Mikrodizi Tabanlı Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (aCGH) Nedir?
Genetik hastalık teşhis teknolojisi büyük gelişme göstermiştir. Araştırmacılar dengesizliklere karşı bütün bir genomun taranması hızla taranması amacıyla günümüzde dizi CGH (aCGH) yöntemini kullanmaktadırlar.
Pek çok genetik rahatsızlık, kapsamındaki genetik unsurlarda artış veya azalma olan kromozom anormalliklerinden kaynaklanmaktadır. Geleneksel olarak sitoloji uzmanları bir kimsenin kromozomlarından karyotip oluşturmak ve bantlama örgülerini analiz etmek suretiyle söz konusu anormallikleri tespit etmişlerdir. Esasında 1970’lerdeki gelişiminin ardından bant örgülerinin sitogenetik analizi, farklı doğumsal anormallikleri olan hastaların klinik değerlendirmesi için birincil araç olarak kullanılmıştır. İdeal koşullar altında yaklaşık 5 megabaz (Mb) kadar küçük olan sapmalar bantlama analizi ile tespit edilebilmektedir. Bu tür kromozom düzenlemelerine “mikroskobik” denmektedir.
Bununla birlikte, araştırmacılar son yıllarda yeni sitogenetik tekniklere daha çok ilgi duymuşlardır. Bu yöntemlerden biri flüoresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemidir. Bu yöntemle kromozomlar üzerindeki spesifik DNA dizilimlerinin konumlarını belirlemek için flüoresan etiketli problar kullanılmaktadır. Bir diğer popüler teknik kıyaslamalı genomik hibridizasyon (CGH) yöntemi olup bu yöntemle kopya sayı türevleri için genom kapsamında alternatif bir tarama tekniği sunulmaktadır. İlk olarak katı tümörler içerisindeki kopya sayısı değişikliklerini tespit etmek amacıyla oluşturulan CGH, farklı etiketlere sahip olan ve rekabetçi bir şekilde metafaz kromozomlarına hibridize edilen test ve kontrol tümörleridir. Referans DNA’sına göreceli olarak etiketli test DNA’sının flüoresan sinyal yoğunluğunu daha sonra her bir kromozom üzerinde lineer bir şekilde dizilebilmektedir. Böylelikle kopya sayısı değişiklikler tanımlanabilmektedir.
Tek bir hedef ve soruşturma kapsamındaki geçmiş bölge bilgilerine dayanan ve kopya sayısı kazanımları ve kayıplarını tespit etmek için kullanılan geleneksel yöntemlerin aksine, CGH bütün bir genom dengesizliklerini hızlıca taramak üzere kullanılabilir. Ek olarak, CGH bölünme sürecinden geçen hücreleri gerektirmemektedir. Bununla beraber, önceki sitogenetik yöntemlerde olduğu gibi, CGH çözümü birçok klinik uygulama için yaklaşık 5-10 Mb boyutundaki değişiklikler ile kısıtlanmıştır.
CGH ile Mikrodizilerin Birleştirilmesi: Dizi CGH Gelişimi Nasıl Gerçekleştirilir?
Araştırmacılar geleneksel CGH’lere ilişkin birtakım kısıtlamaların aşılması amacıyla geleneksel CGH’yi mikrodizilerin kullanımıyla CGH ilkelerini birleştiren yeni bir yöntem geliştirmişlerdir. Dizi CGH olarak bilinen bu yöntem metafaz kromozomlarının kullanımı yerine analiz hedefleri olarak küçük DNA parçaları ile dizilen slaytları kullanmaktadır. Söz konusu mikrodiziler sıralı bir düzen içerisinde cam slayt gibi katı bir destek üzerindeki küçük miktarda DNA’ların (prob olarak bilinmektedir) çökeltisi ve immobilizasyonu ile hazırlanmaktadır. Problar, bakteriyel yapay kromozomlar (80.000–200.000 baz çifti) gibi genomik klonlara ilgi alanlarını (25-85 baz çifti) yansıtmak amacıyla üretilen oligonükleotitlerden boyut olarak farklıdırlar. Probların metafaz kromozomlarından boyut olarak çok daha küçük olmaları nedeniyle aCGH işleminin teorik faydası geleneksel CGH işleminden daha yüksektir. Başarı düzeyi prob boyutunun ve DNA probları arasındaki genomik mesafenin dikkate alınması ile belirlenmektedir. Örneğin, genom üzerinde olan ve aralarında 1 Mb boşluk bulunan bölgelerden seçilen bir prob mikrodizisi, müdahil olan dizinin kopya sayısı değişikliklerini tespit edemeyecektir.
Prob türü fark etmeksizin, aCGH analizine yönelik temel metodoloji tutarlı olmaktadır. İlk olarak, DNA bir test örneğinden (ör. Kan, cilt, cenin hücresi) alınmaktadır. Test DNA’sı daha sonra özel bir floresan boya ile etiketlenmekte iken normal bir kontrol örneğinden alınan DNA (referans) farklı bir renk ile etiketlenmektedir. Test ve referans DNA’ları daha sonra karıştırılır ve bir mikrodiziye uygulanır. DNA’lar denatüre edildikleri için tek bir zincir oluştururlar. Bu nedenle, preparata uygulandıkları zaman dizili ve tek zincirli problarla hibridizasyon gerçekleştirmeye çalışırlar. Daha sonra her bir hedefe hibridize olan etiketli DNA problarının göreceli flüoresan yoğunluklarını bulmak ve miktarlarını ölçmek için dijital görüntüleme sistemleri kullanılmaktadır. Test ve referans hibridizasyon sinyallerinin flüoresan oranı genom üzerindeki farklı konumlarda belirlenmektedir ve normal genoma kıyasla test genomundaki dizilerin göreceli kopya sayısına binaen bilgi vermektedir. İnsan genomunun son zamanlardaki dizilimi ve katı yüzeyler üzerinde genetik unsurların robotik olarak dizilimine ilişkin olan yüksek sonuç oranına sahip yöntemler, mikroskopla görünmeyen kromozom kusurlarının ve kopyaların tespitine eşi benzeri görülmemiş seviyelerde olanak tanımaktadır.
aCGH Teknolojisinin Avantajları Nelerdir?
aCGH’nin öncelikli avantajı bir dizide yansıtılan herhangi bir konumun anöploidilerini, silinmelerini, çoğaltımlarını ve/veya amplifikasyonlarını eşzamanlı olarak tespit edebilmesidir. Esasında, bu tekniği kullanan bir deneme, binlerce FISH deneyine denktir ve araştırmacıya iş gücü ve maliyetten de tasarruf sağlamaktadır. Ek olarak, idiyopatik zihinsel gerilemesi ve farklı doğum kusurları bulunan bireylerde mikroskopla görünmeyen kromozom anormalliklerinin tespiti için aCGH’nin güçlü bir araç olduğu ispatlanmıştır. Pek çok geniş ölçekli çalışmaya göre, doğumsal kusurlarla birlikte veya bunlar olmadan zihinsel engeli/gelişimsel bozukluğu olan çocuklarda kromozom anormalliklerinin %10-20’si aCGH tarafından tespit edilebilmektedir. Bu anormalliklerin yalnızca %3-5 kadarı diğer araçlarla tespit edilebilmektedir. Örneğin, aCGH ile analiz edilen 8789 vakalı bir çalışmada 1049 kişide (%11,9) klinik olarak ilintili kromozom anormalliği tespit edilmiştir.
aCGH’nin Geleceği
aCGH sitogenetik bilimini mikroskoptan bilgisayara aktarmış ve genomun farklı olan yüzlerce veya binlerce bölgesini eş zamanlı olarak analiz etmek ve dengesiz karyotipleri belirlemek üzere CGH’yi yüksek sonuç oranına sahip mikrodizilerle birleştirmiştir. aCGH FISH yönteminin konuma özel doğasını yüksek çözünürlüklü kromozomların global genom görünümü ile birleştirmektedir. Bu nedenle, bu yöntem geleneksel ve moleküler sitogenetik tekniklerin entegrasyonunu temsil etmektedir ve önümüzdeki yıllarda kromozom anormalliklerinin klinik teşhisine eşsiz bir şekilde olanak tanımaya devam edecektir.